六味五灵片主要药效测试方法与结果

• 六味五灵片的保肝降酶实验

1 对四氯化碳致大鼠慢性肝损伤的影响 [1] ；取 istar 大鼠，按体重随机分为 6 组，每组 10 只，正常对照组、肝损伤模型组、护肝片组、六味五灵片高、中、低（ 4 、 2 、 1g 生物药 /kg ）三个剂量组。除正常对照组外。各组动物腹腔注射（ ip ） 30% 四氯化碳（ CCl₄ ）植物油 0.2ml/ 100g 体重，每周两次，共七周，正常对照组 ig 同体积的盐水。造模同时每日灌胃（ ig ）给药一次（ 1ml/ 100g ）体重，正常对照组 ig 同体积的蒸馏水，连续给药 7 周。实验结束前，动物禁食 12 小时，将动物摘眼球采血，以 3000 转 / 分离心 10 分钟，分离血清，测定大鼠血清谷丙转氨酶（ ALT ）、谷草转氨酶（ AST ）、总蛋白（ TP ）、白蛋白（ ALB ），采血后将动物处死，取肝组织作羟脯氨酸测定，计算肝胶原蛋白含量 [2] （结果见 1 、 2 ）。同时取一部分肝组织，做组织化学及组织病理学检查（结果见附件 1 、照片 1 ）。

表 1 六味五灵片对四氯化碳致大鼠慢性肝损伤的影响（ n=10 ）

组别	剂量	肝功能（ X ± SD ）
组别	g/kg	ALT （чmol/s）/L	ALT （чmol/s）/L	TP （чmol/s）/L	ALB （g/dL）	白/球 (g/dL）
对照组		268.00 ± 20.86	634.80 ± 22.51	69.50 ± 4.56	40.60 ± 3.45	1.06
模型组		797.60 ± 32.29	1458.0 ± 27.75	59.50 ± 5.60	30.60 ± 4.40	1.41
护肝片	0.4	507.60 ± 25.36	935.20 ± 25.21	67.50 ± 10.20	36.20 ± 2.48	1.16
六味五灵片	4	464.40 ± 23.90	832.00 ± 34.08	65.89 ± 5.05	37.20 ± 3.26	1.30
	2	2540.80 ± 32.65	860.86 ± 26.71	65.10 ± 4.87	35.20 ± 2.21	1.17
	1	528.00 ± 21.92	959.20 ± 28.48	60.80 ± 6.29	34.30 ± 2.01	1.30

与正常组比较 #p<0.05##p<0.01 以下均同：与模型组比较 *p<0.05**p<0.01

表 2. 六味五灵片对大鼠肝胶原蛋白含量的影响（ X ± SD ）

组别	剂量	动物数	胶原蛋白
组别	g/kg	（只）	（ч g/mg 干肝）
对照组		10	22.99 ± 7.21
模型组		10	53.50 ± 11.77
护肝片	0.4	10	40.73 ± 15.43
六味五灵片	4	10	39.58 ± 16.11
	2	10	36.58 ± 14.07
	1	10	42.50 ± 10.59

与模型组相比， *p<0.05 **p<0.01

表 1 、 2 结果表明六味五灵片可抑制多次注射四氯化碳（ CCI 4 ）引起的大鼠血清转氨酶的升高、总蛋白（ TP ）和白蛋白（ ALB ）降低，减少肝胶原蛋白含量。

2 ．对 D ——半乳糖胺所致小鼠急性肝损伤的影响 [3] 取健康小鼠 60 只随机分为六组，即正常对照组、 D- 半乳糖胺（ D-GaIN ） 650mg/kg 模型组、护肝片组、六味五灵片（ 8 、 4 、 2g /kg ）三个剂量组，每组 10 只。每日灌胃（ ig ）给药，连续四次，对照组及模型组给与相同容积的蒸馏水，末次药后一小时，除正常对照组外，小鼠腹腔注射（ ip ）半乳糖胺 0.2ml/ 只，造模后 20 小时，小鼠眶静脉采血，测血清谷丙转氨酶（ ALT ）、谷草转氨酶（ AST ）值（表 3 ），并取肝组织作病理学检查（结果见附件 2 、照片 2 ）。

表 3. 六味五灵片对 D-GaIN 致小鼠急性肝损伤的影响（ X ± SD ）

组别	剂量	动物数	ALT	ALT
组别	g/kg	（只）	（ч mol/s ）/L	（ч mol/s ）/L
对照组		10	245.60 ± 7.93	664.40 ± 24.35
模型组		10	668.80 ± 21.01	1262.4 ± 53.61
护肝片	0.8	10	338.00 ± 17.80	803.20 ± 36.36
六味五灵片	8	10	331.60 ± 24.04	820.80 ± 26.67
	4	10	400.80 ± 27.04	829.60 ± 33.38
	2	10	468.4 ± 28.23	949.60 ± 27.62

与模型组相比， *p<0.05 **p<0.01

表 10. 六味五灵片在鸭体内对鸭乙型肝炎病毒 DHBV-DNA 的影响

组别	剂量	动物数	DHBV-DNA 水平
组别	g/kg	( 只 )	L	T 均数	T	P
对照组		6	0.42 ± 0.11	0.42 ± 0.13	0.44 ± 0.12	0.42 ± 0.11
模型组		6	0.35 ± 0.15	0.26 ± 0.00	0.25 ± 0.07	0.22 ± 0.07
六味五灵片	4.2	6	0.41 ± 0.14	0.30 ± 0.09	0.26 ± 0.10	0.25 ± 0.09
	22	6	0.46 ± 0.09	0.41 ± 0.08	0.38 ± 0.09	0.34 ± 0.11
	11	6	0.44 ± 0.13	0.40 ± 0.13	0.39 ± 0.16	0.37 ± 0.15
无环鸟苷	5.5	6	6 0.51 ± 0.14	0.27 ± 0.12	0.15 ± 0.05	0.33 ± 0.13

给药组各时相 (T o ,T 5 ,T 10 ,P 3 )DHBV DNAOD 值与病毒对照组各时相 DHBV-DNAOD 值比较， **P<0.01 *P<0.05

结果见表 10 ，六味五灵片可使鸭乙型肝炎病毒感染的鸭血清中鸭乙型肝炎病毒 DNA （ DHBVNA ）水平下隆。并且，随着给药剂量增加和时间推移，对乙肝病毒抑制作用增强，呈现一定剂量和时间依赖性。停药后，没有出现由于病毒再复制而产生的“反跳”现象。

2 ．在 2.2.15 细胞内对乙型肝炎病毒表面抗原、 e 抗原的抑制作用 [11] 药物六味五灵片用培养基配制成含生药 16g /L 溶液，以 2 倍稀释至 8 、 4 、 2 、 1 、 0.5\0.25mg/ml 加入 96 孔细胞培养板，每浓度 4 孔，每 4 天换同浓度药液，设无药细胞对照组，以观察细胞病变为指标， 8 天显微镜下观察细胞病变，完全破坏为 4 ； 75% 为 3 ； 50% 为 2 ； 25% 为 1 ；无病变为 0 。计算每浓度药液平均细胞病变程度和抑制百分率。按 Reed Meuench 法计算 50% 毒性浓度（ TC 50 ），无毒浓度（ TC 0 ），见表 11 。

50—50% 抑制百分率

A=log.50% 抑制百分率 B=log<50% 药物浓度 C=log 稀释倍数

表 11 六味五灵片对 2.215 细胞的毒性作用

药物浓度	细胞病变	破坏百分率 %	TC₅₀ ( mg/ml )	TC₀ ( mg/ml )
16	4 4 4 4	100	9.18	4
8	2 2 1 1	37.5
4	0 0 0 0	0
2	0 0 0 0	0
1	0 0 0 0	0
0.5	0 0 0 0	0

表 11 表明，六味五灵片对 2.2.15 细胞产生 50% 毒性浓度（ TC₅₀ ）为 9.18mg/ml ，无毒性浓度（ TC₀ ）为 4mg/ml ，提示六味五灵片对 2.2.15 细胞的药效浓度应选择 4mg/ml ，并在此浓度以下 2 倍稀试验药液。

以每毫升 10 个 2.2.15 细胞接种 24 孔培养板，每孔 lml ， 37 ℃ 5%CO 2 培养 24 小时，加无毒浓度以下 2 倍稀释度验药液， 5 个稀释度分别为 4 、 2 、 1 、 0.5\0.25mg/ml, 每浓度 3 孔， 37 ℃ 5%CO 2 培养，每 4 天换的浓度药液培养，第 8 天收集培养液， -20 ℃ 冰冻保存。参照固相放射免疫测定盒说明书测定，用γ计数仪测定每孔 cnm 值，实验设 Hbsag 、 HbeAg 阳性和阴性对照。见表 12 、 13

表 12 六味五灵片在 2.2.15 细胞中第 8 天对表面抗原的影响

药物浓度 mg/ml	Cpm(X ± S)	抑制率 %	P/N 5	IC₅₀ ( mg/ml )
4	1887 ± 127	31.5	12.94	3.33
2	2058 ± 245*	24.6	14.41
1	2211 ± 354	18.3	15.24
0.5	2363 ± 239	12.1	16.32
0.25	2528 ± 174	5.4	17.49
细胞对照	2661 ± 279
阳性对照	23951
阴性对照	203
空白对照	62

与细胞对照相比， **P<0.01 *P<0.05

结果见表 12 、 13 ，六味五灵片在无细胞毒性浓度范围内，随着六味五灵片药液浓度增中，对表面抗原（ HBsAg ）、 e 抗原（ HBeAg ）的抑制程度亦增加，提示六味五灵片对 2.2.15 细胞 HBeAg 、 HBeAg 具有一定抑制作用并呈剂量依赖性。